PCR

1. Genet.
DNA-molekula baten harizpiak kopiatu eta kopia-kopuru handia sortzeko erabiltzen den teknika.

Polimerasaren erreakzio kateatua Edit

Egilea: Koldo Garcia, Begoña Jugo

POLIMERASAREN ERREAKZIO KATEATUA

DNA-sekuentzia jakin baten kopia ugari lortzeko teknika da. Zelulek DNA bikoizteko duten mekanismoan oinarritua dago, baina in vitro, hots, hodi batean, egiten da. Anplifikatuko den eskualdea mugatzeko, espezifikoki diseinaturiko bi hasle (bat harizpi bakoitzeko) erabiltzen dira, anplifikatu beharreko sekuentziaren alboetako sekuentziekiko osagarriak diren 20-24 oligonukleotidoak, hain zuzen ere. Bestalde, DNA berriaren sintesirako, tenperatura altuak jasateko gai diren entzima bereziak erabiltzen dira; erabiliena Thermus aquaticus izeneko bakterio termofilikotik lortutako Taq polimerasa da. Entzima horrek harizpi berria osatuko du, hasleari atxiki eta desoxirribonukleotido trifosfato molekulak gehituz, intereseko DNA jakinaren harizpi bakuna moldetzat hartuta. PCR teknika pauso ziklikoetan egiten da, eta pauso bakoitzean tenperatura jakin bat finkatzen da. Hortaz, prozesua hiru pausoren errepikapenean datza. Tenperatura-aldaketak honelakoak izaten dira: desnaturalizazio-fasean, DNAren helize bikoitza osatzen duten harizpiak banandu daitezen, tenperatura 95 °C ingurura igotzen da; hasleen lotura-fasean, hasleak modu espezifikoan DNAri lot dakizkion, tenperatura 60 °C ingurura jaisten da; eta luzapen-fasean, polimerasak, harizpi bakunen osagarriak diren DNA-harizpi berriak osatzeko, 75 °C ingurura igotzen da tenperatura. Polimerasaren erreakzio kateatu deritzo berriki sintetizatutako DNA-harizpiak hurrengo zikloetan DNA sintetizatzeko molde moduan funtzionatuko dutelako. Ziklo bakoitzean, DNA-kantitatea bikoizten da, eta, ziklo bakoitzak minutu gutxi batzuk irauten dituenez, jatorrizko sekuentziaren milioika kopia lor daitezke ordu gutxi batzuen buruan. Prozesu guztia automatikoki egiten da termoziklagailu deritzon aparatu batean.

Oinarrizko PCR horrez gain, badaude beste PCR-aldaera batzuk ere. Horien artean, aipagarriak dira RT-PCRa, RNA anplifikatzeko erabiltzen den aldaera, edota laginean azido nukleikoen kantitatea kuantifikatzeko erabiltzen den PCR kuantitatiboa.

Aurretik hainbat saiakera egin baziren ere, onartzen da PCR teknikaren asmatzailea Kary Mullis izan zela. Kary Mullisek 1985. urtean garatu zuen teknika, eta 1993an Nobel saria jaso zuen PCRa asmatzeagatik.

Teknika honen garapenak eragin izugarria izan du ikerkuntzan, medikuntzan eta auzitegi-ikerketetan, metodologia sentikorra, azkarra eta merkea delako.

Medikuntza-diagnosian, infekzioak sortzen dituzten bakterioak eta birusak detektatzeko erabiltzen da. Adibidez, GIBa, hepatitisa, zitomegalobirusa… detektatzeko. Mikroorganismo jakinetarako hasle espezifikoak diseinatuz, gaixoaren odolean edo ehunetan izaki horien presentzia detekta daiteke.

Analisi genetikoetan, pertsona batek bere ondorengoei pasa diezazkiokeen mutazio genetikorik (adibidez, fibrosi kistikoa sortzen duena) duenetz, edo pertsona batek gaixotasun bat jasateko duen arriskua zehazteko ere PCRa erabiltzen da. Adibidez, BRCA delako genearen mutazioek ugatz- edo obario-minbizia izateko aurretiko joera handitzen dute emakumeetan. Bada, PCRaren bidez, mutazio horiek detekta daitezke.

Aitatasun-frogak edo hainbat auzitegi-froga ere PCRan oinarritutakoak dira. Indibiduo susmagarrien laginetan eta identifikatu beharreko laginean DNA-sekuentzia bera anplifikatzen da PCRaren bidez, eta, sekuentzia anplifikatu horiek erkatuz, aztergai den lagina identifika daiteke. Arrasto txikietatik (auzitegi-ikerketaren kasuan) edo endekatuetatik (antzinako arrastoetatik) DNA-kantitate handiagoa lortu nahi denean, PCR teknika erabiltzen da.

Azkenik, PCRa antzinako laginen analisirako eta erlazio ebolutiboak aztertzeko ere erabil daiteke. Zenbait izakitan gene bera anplifikatu eta sekuentziatu ondoren, euren arteko antzekotasun/desberdintasunak aztertzen dira. Sekuentzia genetiko antzekoagoak dituzten izakiak ebolutiboki hurbilago egon ohi dira.