Bereizte kromatografikoak

Kromatografia hitza erabili zuen lehena Tswett errusiarra (1872-1919) izan zen. Landareen pigmentuen klarionaren bidezko bereizketa adierazteko, hain zuzen ere, kromatografia hitza erabili zuen. Hala ere, XX. mendeko 30eko hamarkadara arte ez zen kromatografia erabili, harik eta geruza meheko kromatografiaren eta ioi-trukearen erabilera zabaldu ziren arte.

Oro har, kromatografiak bereizketa-metodo fisikoen multzo zabala biltzen du. Hala ere, gainerako bereizketa-metodoak ez bezala, osagaiak bereizteko erabiltzen diren bi faseek ezaugarri bereizgarri bat dute: bata geldikorra izatea, eta bestea, berriz, mugikorra izatea. Nolanahi ere, kromatografiak sailkapen asko eta askotarikoak ditu, batez ere kontuan izanda nolakoak diren faseak, zeintzuk diren bereizketaren mekanismoak eta zein baldintzetan gertatzen diren bereizketak.

Alde batetik, fase geldikorra zutabean paketatua, geruza lauan zabalduta edo geruza mehean banatuta egon daiteke. Hori dela eta, edozein kasutan, fase geldikorrari ohantze kromatografiko deritzogu. Fase mugikorra, bestaldetik, gasa, likidoa edo jariakin superkritikoa izan daiteke. Bi faseen arteko konbinazioen bitartez, bereizketa kromatografikoen lehen sailkapena egin daiteke.

Era berean, fase geldikorrak itxura askotarikoak izan ditzake, eta horien arabera azpisailkapenak egin daitezke. Besteak beste, bereizketa kromatografiko hauexek nabarmendu daitezke: fase geldikorra geruza lauan barreiatua badago, aluminiozko, beirazko zein plastikozko gainazalaren gainean, orduan, geruza meheko kromatografia edo kromatografia laua izango genuke; paperaren gaineko geruza bada, paper-kromatografia litzateke; eta, azkenik, beirazko zutabea edo metalezko hodian egokituko bagenu ohantze kromatografikoa, orduan, zutabe-kromatografia genuke.

Fase geldikorra likidoa dela esaten denean, euskarri solidoari atxikitako fase likidoa dugula ulertu behar da: bestela, fluxuak eramango luke fase geldikor hori. Atxikitze hori fase solidoaren gainazalean gertatzen da lotura kimikoaren bitartez, geroago ikusiko denez.

Gas-kromatografia zutabean soilik egin daiteke, baina likido-kromatografia, zutabean zein geruza lauan. Ohiko likido-kromatografia barne-diametro zabaleko zutabeetan gauzatzen zen (Ø = 1-2 cm), eta oraindik ere erabiltzen da prestatze -kromatografia egiteko. Egun, berriz, kromatografia analitikoak, bereizmen handiko kromatografia likidoak edo likido-kromatografiak, hain zuzen, zutabe estuak erabiltzen ditu (Ø = 1-4,6 mm) eta fase mugikorraren fluxua 0,1-5 cm3 ·min-1-ko izaten da.

Zutabe-kromatografiak, bere aldetik ere, azpisailkapenak izan ditzake zutabearen neurriaren eta ohantzearen arabera, eta, besteak beste, zutabe paketatuak edo kapilarrak ditugu. Fase geldikorrak euskarri solido geldoaren gainazala estaltzen badu edo horiekin lotuta badago, zutabea paketatua dela esaten da. Aldiz, fase geldikorra zutabearen barne-hormari atxikitzen bazaio, orduan, horiek hodi-zutabe irekiak edo kapilarrak dira, bigarren irudian ikus daitekeen bezala.

Fase mugikorra pasatu ahala, osagaiak bereizi egiten dira; gertakari horri eluzio deitzen diogu. Lehenik eta behin, lagina dagokion disolbatzaile batean disolbatu ondoren, haren bolumen txikia injektatzen da; geroago, fase mugikorrak eramango ditu osagaiak ohantze kromatografikoan zehar, eta, bukaeran, baldintzarik egokienetan, osagaiak banan-banan irtengo dira. Bereizte horren oinarrian, fase geldikorraren, mugikorraren eta osagaien arteko elkarrekintzak daude, zeinek osagaien atxikitzea azaltzen baitute.

Horrenbestez, 1. taulan bildu da metodo kromatografikoen sailkapen osatua, non atxikitzearen mekanismo fisiko-kimiko erabilienak kontuan hartu baitira. Mekanismo nagusi horiek hauexek dira: adsortzioa, banaketa, ioi-trukea eta permeazioa. Horiei afinitatea eta elektromigrazioa gehitu dakieke, entzima-substratu elkarrekintzak eta elektroforesian oinarritutako bereizketa-mekanismoak sartzeko.

Atxikitze-mekanismoaren araberako metodo kromatografikoen sailkapena

Bereizketaren mekanismoak

Metodo analitikoen erabilera azterturik, oro har, bi heren metodo kromatografikoak direla uste da. Izan ere, bereizketaren mekanismoak oso bestelakoak izatea da erabilera zabal horren ardatz nagusietariko bat, erabiltzeko aukeren aniztasunarekin batera. Hori dela eta, bereizi egin daitezke osagai polarrak zein apolarrak, lurrunkorrak edo lurrungaitzak, ionikoak edo molekularrak, tamaina txikikoak edo polimeroak, baldintza aproposak aukeratuz gero.

Osagaiak atxikitzeko mekanismoa bakarra balitz, alde batetik, errazagoa litzateke osagai horien eluzioa nolakoa den jakitea, baina bestetik, askozaz aplikazio gutxiago izango lituzke. Are gehiago, bereizketa kromatografikoaren mekanismoa finkatu arren, aldagai eragingarri asko eta hainbat motatakoak ditugunez, ez da oso erraza suertatzen nahaste baten eluzio zehatza aurresatea. Nolanahi ere, egokia da mekanismo horien funtsa ematea eta horren arabera bereizketaren ezaugarriak balioestea, metodo askoren oinarria baita.

Adsortzioa

Adsortzioa solidoek duten gaitasun bat da, inguruan dauden osagai batzuk partikula solidoen gainazalean harrapatzeko gaitasuna, hain zuzen. Adsortzioaren bidez, solutuen eta disolbatzailearen molekulak lehian ari dira adsorbatzailearen gune eraginkorrarekin bat egiteko. Horren ondorioz, edozein osagairen molekula bat gune horretara heltzeko, aldez aurretik zegoen disolbatzailearen molekula ordeztu behar du.

Adsorbatzailea polarra bada (silika edo alumina, esaterako) osagai apolarrek (hidrokarburoek, adibidez) oso atxikitze apala agertuko dute, eta ez dira atxikirik geratuko. Funtzio-talde polarra (alkohola, zetona, amina...) edo polarizagarri (eraztun aromatikoa) dutenek, aldiz, atxikitze handiagoa agertuko dute, eta luzaroago atxikiko dira.

Banaketa

Atxikitze-mekanismoa banaketa bada, aurreko solido adsorbatzailearen ordez fase likido bat dugu. Partikula solidoaren inguruan dagoen geruza likido bat da, eta, lehen ez bezala, osagaien absortzioaren bitartez egiaztatzen da bereizketa kromatografikoa. Likido-kromatografia denean, fase likidoa disolbatzaile bat izan daiteke, edo geroxeago aztertuko den fase lotua; gas-likido kromatografian, berriz, fase likidoa hodiaren barne-hormari atxikita dago eramana izan ez dadin.

Bereizketaren oinarria, beraz, faseen arteko disolbagarritasunen erlazioa da, Kd-aren bitartez adierazten dena, hain zuzen ere. Orobat, konstante horren araberako eluzioa espero behar da; hau da, zenbat eta handiagoa izan Kd atxikitzea orduan eta luzeagoa da.

Ioi-trukea

Fase solido polimerikoen gaineko funtzio-talde ionikoen ezaugarrietan oinarriturik, katioi- eta anioi-trukatzaileak eratu daitezke bereizketa kromatografikoak egiteko. Mekanismo horren xehetasunak dagoeneko ezagunak dira, eta analito askoren bereizketa eta analisia lortzeko berezitasun gehigarri bakarra hauxe da: presio eta eraginkortasun handiko baldintzetan aplikatzea. Izan ere, ioi-trukatzaileak paketatu ostean, eraginkortasun handiko kromatografia likidoko beste hainbat metodoren artean erabil daitezke.

Molekula-baztertzea

Aurreko mekanismoak ez bezala, honako hau ez datza inolako elkarrekintza espezifikotan. Are gehiago, mekanismo honen bidezko bereizketa kromatografikoak erabiltzeko gainerako mekanismoen eragina, batez ere, adsortzioarena, ahalik eta mugatuena dela ziurtatu behar da. Baztertze kimikoaren kromatografia silikazko edo gel polimerikozko fase geldikor porotsuaren bidez gertatzen da. Fase geldikorraren poroak bitarte fisiko mugatuan agertzen dira, tamainari dagozkionak batez ere, eta soilik bitarte horretan dira eraginkorrak. Hau da, poroak baino handiagoak diren molekulak ezin dira poroetan sartu, eta, beraz, ez dute inolako atxikitzerik. Aldiz, poroak baino askoz txikiagoak diren molekulak, behin poroetan sartu direnean, nekez aska daitezke. Gertakari hori, poroaren eta analitoen tamainaren araberako bereizketa eta bereizketa kromatografikoaren ondorioak agerian geratzen dira.

Bereizketa kromatografikoaren oinarriak

Lehenago esan den bezala, kromatografiaren bidezko bereizketan, fase mugikorrak garraiatzen ditu lagineko analitoen partikulak. Hori dela eta, osagaiak, fase mugikorrak eta fase geldikorrak sistema hirukoitza eratzen dute, eta elkarrekintzak daude horietako bi edozeinen artean. Fase geldikorraren eta osagaien arteko elkarrekintzak, zeinak osagai bakoitzaren araberakoak baitira, eluzioaren atzerapena dakar. Beraz, fase mugikorra eraman ahala, osagaiak elkarrengandik aldentzen dira, eta, eluzioaren bukaerara, banan-banan heltzen dira.

Aurretik aztertu diren atxikitze-mekanismoak bat baino gehiago izan arren, analito bakoitzaren (A, B, C...) bi faseen arteko banaketa desberdinari egotz dakioke nabarmendutako aldentze hori, oreka orokor honek adierazten duen bezala:

$A_m\iff A_g{K}_d=\frac{\left[A_g\right]}{\left[A_m\right]}$

non Ag eta Am fase geldikorreko eta fase mugikorreko A-ren kontzentrazioak baitira, hurrenez hurren. Dakigun bezala, banaketa-konstantea (Kd) kontzentrazio horien arteko zatiketa da, eta, Kd handitu ahala fase geldikorrarekiko atxikitzea handiagoa denez, eluzioa motelago gertatuko da.

Hala ere, kromatografia bereizketa dinamikoa denez gero, goiko ekuazioak ematen duen egoera ez da erabat betetzen urrats bakoitzean, baizik eta urratsen segida batean. Izan ere, urrats bakoitzean oreka lortzen dela hurbiltze soila da, oreka, berez, hainbat mailatan, urratsez urrats, lortzen baita. Hala ere, bereizketa dinamikoaren deskripzioa samurtzeko, onar daiteke urrats bakoitzean banaketa-erlazioa neurri handi batean betetzen dela. Hori dela eta, urrats bakoitzari zutabearen plater teoriko deritzogu, zeina zutabearen zeharreko ebakidura gisa ikus baitaiteke, eta, destilazioan erabiltzen den esanahi bertsua dauka. Hurrengo irudian ikus daitekeen bezala, plater teorikoari dagokion luzera plater teorikoaren garaiera baliokidea (H) da. Oro har, beraz, H zenbat eta txikiagoa izan, urrats gehiago ditu zutabeak eta bereizketa eraginkorragoa izango da.

Bereizketa kromatografikoaren urratsez urratseko adierazpena eta plater teoriko bakoitzeko garaiera baliokidearen (H) irudikapena

Plater teoriko bakoitzean osagaiak bakoitzaren Kd-aren arabera banatu izanak osagaien arteko bereizketa dakar: gutxi banatzen diren osagaiek arinago zeharkatuko dute zutabea, eta gehiago banatzen direnek, motelago. Horren irudia eta ondorio kuantitatibo adierazgarriena kromatograma da. Esan bezala, kromatograman bereizitako osagaien gailurrak agertzen zaizkigu, eta gailur horiek nola antolatzen diren ikusirik, bereizketaren egokitasuna eta ondorio analitikoak lor daitezke; hau da, jakin daiteke zenbat osagai ditugun, nolakoak diren osagai batzuk eta zein den zenbaiten kontzentrazioa. Adibide gisa, bigarren irudian kromatograma bat jaso dugu, eta horretan agerian dauden ezaugarriak batu ditugu.

Fase mugikorrean dauden lagineko partikulak (molekulak/ioiak), faseen arteko mugen bitartean higitzen diren arren (noranzko guztietara, hain zuzen), fase mugikorraren noranzko higidura lineala da nagusi. Fase mugikorrak abiadura konstantea du ($u_m$), bai eta horrekin batera dauden partikula guztiek ere. Hau da, lagineko partikulak fase mugikorrean dauden bitartean, abiadura lineal bera izango dute, eta fase mugikorraren denbora bera beharko dute zutabea zeharkatzeko, fase geldikorrarekin inongo elkarrekintzarik eduki ezean. Denbora horri zutabearen eduki-denbora edo denbora hila deritzogu (tm), eta horren bidez adierazten da fase mugikorrak zutabea zeharkatzeko behar duen denbora.

Fase geldikorrarekiko atxikitzeren bat duten partikulak aldizka fase geldikorrean agertuko dira. Fase geldikorraren eta osagai bakoitzaren arteko elkarrekintzei esker, osagaien atxikitzea (ts) gertatzen da. Hori dela eta, osagai bakoitzak bere atxikitze-denbora (tR) du: aurreko bi denboren batura (tR = ts + tm), zutabea zeharkatzeko behar duen denbora, hain zuzen ere.

Kromatograma baten ezaugarri orokorrak: atxikitze-denbora (tR) eta zutabeko denbora hila (tm)

Ikuspuntu instrumentaletik, analisi kimikoak egiteko bereziki, bereizte kromatografikoko sistemak lotu behar dira detekzio instrumentala bermatzen duen sistema batekin. Zentzu horretan, aurki daitezkeen konbinazioak asko dira, eta adibidez, gas-kromatografia, garraren bidezko ionizazioa (FID, flame ionization detector), eroaletasun termikoa (TC, thermal conductivity), elektroi harrapaketaren detekzioa (ECD, Electron capture detector) edo masa-espektrometriarekin (MS, mass spectrometry) lot daiteke; kromatografia likidoa, aldiz, ultramore-ikusgai espektrofotometria edota fluoreszentzia- edo masa-espektrometriarekin lotuta dago.