Klonazioa izaki bizidun baten kopiak egiteko prozesua da. Biologian, eskuarki, DNA-zatien, organismoen edo zelulen kopia berdin-berdinak egitea esan nahi du.

Klonazio molekularra

Klonazio molekularraren teknikaren bidez, DNA-sekuentzia jakin bat (gene oso bat, gene-zatia, sekuentzia ez-kodetzailea edo zoriz moztutako DNA-zatia izan daitekeena) isolatzen da, eta in vivo, hots, zelulak erabilita, haren kopia ugari eskuratzen dira. Esperimentu biologiko askotan erabiltzen da teknika hau, eta aplikazio praktiko anitz ditu. Zeluletan oinarritutako DNAren klonazioa 70. hamarkadaren hasieran garatu zen murrizte-endonukleasen —DNA-sekuentzia jakin bat ezagutu eta mozten duten entzimak— aurkikuntzaren ondorioz.

DNA-zati baten klonazioak funtsean lau pauso ditu: DNA eta bektorea isolatzea eta/edo moztea, lotzea, transformatzea eta bahetzea edo aukeratzea.

Klonazio-prozesuko pausoak

Bektorea eta klonatu nahi den DNA prestatzea/isolatzea eta murrizte-entzima bidez moztea

Lehen pausoa da klonatu nahi den DNAren eta klonazioan erabiliko den bektorearen kantitate handiak isolatzea. Klonaziorako DNA-zatiak prestatzea zenbait teknikaren bidez egin daiteke: murrizte-entzimen bidez, haiek moztuz; PCR (polimerasaren erreakzio kateatua) bidez, haiek anplifikatuz; sonikazio bidez; eta gel-elektroforesi bidezko zatikapenaz.

Klonazio-bektoreei dagokienez, teknika honetan ezinbesteko elementuak dira, klonatu nahi den DNA arrotza zelula ostalari batean erreplikatzea ahalbidetzen duten DNA-molekulak direlako, hain zuzen ere. Mota honetako molekula batek hiru ezaugarri bete behar ditu, gutxienez: zelula ostalari batean, kromosomarekiko independenteki, bere burua erreplikatzeko gaitasuna izatea, DNA arrotza txertatzeko klonazio-leku bat izatea, eta DNA arrotza jaso duten bektoreak aukeratzea ahalbidetzen duten markatzaileak izatea. Oro har, antibiotikoekiko erresistentzia agertzen duten edo kolore bidezko kolonien aukeraketa ahalbidetzen duten molekulak izan behar dute.

Zenbait bektore-mota erabil daitezke klonaziorako. Erabilienak, plasmidoak dira. Plasmidoak beren burua erreplikatzeko gaitasuna duten kromosomaz kanpoko DNA-molekula zirkular txikiak dira. Tamaina handiagoko DNA-zatiak klonatzeko, hauek erabil daitezke: fagoak, BACak (bakterioen kromosoma artifizialak), YACak (legamien kromosoma artifizialak) edo kosmidoak (hau da, plasmidoen eta fagoen ezaugarriak dituzten plasmidoak).

Plasmidoa duen zelula dentsitate handian hazi ondoren, lisatu egiten da, eta plasmidoa isolatu eta kontzentratu egiten da. Egun, mota anitzeko klonazio-bektoreak komertzialki eskuragarri daude.

Murrizte-entzima bidez moztea

Kasu batzuetan, nahi den DNA-sekuentzia isolatu ahal izateko, tamaina egokiko zatitan moztu behar da. Zati horiek bektoreak DNA-sekuentzia arrotz bat onartzeko duen gaitasunaren araberakoak izango dira.

Helburu horretarako, murrizte-entzimak erabiltzen dira; DNAn nukleotido-sekuentzia espezifiko bat ezagutu eta mozten duten entzimak dira. Erabiltzen den murrizte-entzimaren arabera, mutur kamutsak (bi DNAren harizpiak leku berean moztuz) edo mutur itsaskorrak (nukleotido gutxi batzuetako aldearekin moztuz) sor daitezke. Klonatu nahi den DNA eta bektorea murrizte-entzima berberarekin moztea da egokiena, bi molekulen artean erraz lot daitezkeen edo elkarren osagarri diren muturrak sortzeko.

Murrizte-entzimek DNA-sekuentzia jakin bat ezagutu eta mozten dute

DNA arrotza bektorearekin ligazio bidez lotzea

Klonatu nahi den zatia bektorean barneratu behar denez, digeritutako DNA eta bektorearen DNA ligasa deituriko entzima batekin inkubatzen dira. Erreakzio hori modu egokian aurrera eraman ahal izateko, erabilitako murrizte-entzimak nolako muturrak sortu dituen kontuan izan behar da.

Moztutako DNA eta bektorea ligazio-erreakzioa egiteko nahasten direnean, hainbat motatako molekulak ager daitezke. Alde batetik, lortu nahi diren DNA birkonbinatuen molekulak (jatorri ezberdineko DNA elkartuz eratuak) agertuko dira, bektorea eta klonatu nahi den DNA-molekula (intsertu deitua, bektorean txertatzen delako) molekula zirkular bat osatzeko lotzen direnean. Klonaziorako balio ez duten bestelako produktuak ere agertuko dira, bektorea berriz bere buruarekin edo DNA-zatiak beren artean lotzen badira.

Ligazio-prozesua

DNA zelula ostalarira transformazio bidez barneratzea

Ligazioaren ostean, DNA-intsertua jaso duten bektoreak zelula ostalarietan barneratu behar dira, kopia ugari sortzeko. Klonazio-teknikan, bakterioak dira ostalari-zelula gisa erabilienak, baina legamia- edo ugaztun-zelulak ere erabili daitezke. Transformazio deritzon prozesuaren bidez, ostalari-zelulek DNA arrotza barneratzen eta espresatzen dute.

Transformazioa posible izan dadin, ostalari-zelula konpetenteak edo DNA-molekula arrotzak barneratzeko gaitasuna duten zelulak behar dira. Erabiltzen diren zelula-anduiek gaitasun hori modu naturalean ez badute, laborategi-kondizioen bidez eragin daiteke, elektroporazio edo shock termiko izeneko teknikak aplikatuta, besteak beste.

DNA arrotza jaso duten zelulak aukeratzea eta haztea

Transformaturiko zelulak Petri kutxetan ereiten dira, haz daitezen. Agertuko den kolonia bakoitza zelula bakar batetik eratorria denez, kolonia bateko zelula guztiak genetikoki berdin-berdinak izango dira. Transformazioak zelula gutxi batzuetan bakarrik izan ohi du arrakasta, eta, hortaz, ezinbestekoa da transformatuak izan diren zelulak transformatu gabeko zeluletatik ezberdintzea. Bestalde, bektore birkonbinatua, eta soilik bektorea, barneratu dutenak ere desberdindu behar dira. Egun, klonazio-bektoreek aukeraketa hori ahalbidetzen duten markatzaileak dituzte; antibiotikoekiko erresistentzia agertzen duten markatzaileak eta/edo kolore bidezko aukeraketa ahalbidetzen duten markatzaileak erabiltzen dira. Klonaziorako α-konplementazioaren entsegu delakoan (entsegu urdin/zuria ere deitua), klonazio-prozesuan erabiliko diren bakterio-anduiek, antibiotiko jakin batekiko sentikorrak izateaz gain, lacZ genearen (β-galaktosidasa kodetzen duen genearen) zati bat faltako dute. Bektoreek antibiotikoekiko erresistentzia agertzen duten geneak eta lacZ genea osatzeko sekuentziak dituzte, eta azken horren baitan estrategikoki kokatuta, DNA txertatzeko gunea egoten da. Hazkuntza-ingurune selektiboan soilik plasmidoa jaso duten zelulak haziko dira, antibiotikoaren presentzian. DNA-intsertua jaso duten plasmidoek lacZ genea etenda dutenez, zelula horiek ezin dute hazkuntza-inguruneko galaktosa berezia metabolizatu, eta kolore zuriko koloniak agertuko dira. Soilik plasmidoa jaso duten zelulen koloniak, aldiz, kolore urdinekoak dira.

Kolonia zurietatik zelulak isolatu, eta kantitate handian hazten dira. Zelulak ugaritu ahala, plasmidoa eta, hortaz, intsertua, ere ugalduko dira. Behin zelulak eta DNA-intsertua duten plasmidoak dentsitate altuan hazita, plasmidoa zelula-ostalarietatik erauzi eta isolatzen da; azkenik, murrizte-entzimen bidez plasmidoa eta DNA-zatia bereiz daitezke.

Klonazio molekularreko teknikaren beste aplikazio bat liburutegi genomikoen edo genoteken sorrera da. Mota honetako DNA-molekulen bilduma bat eratzeko, organismo baten genoma erraz maneiatzeko moduko zatitan mozten da, murrizte-endonukleasen bidez. Ondoren, DNA-zati horiek klonazio-bektoreetan sartu, eta zelula ostalarietan barneratzen dira, ikerketan erabiltzeko edo epe luzerako gorde ahal izateko.

Ugaltze-klonazioa edo organismoen klonazioa

Naturan, berez, klonazio-prozesuak gertatzen dira. Izaki zelulabakarrek, mitosiz banantzean, beren buruaren klon bat eratzen dute. Zenbait landare gai dira kimu berriak sortuz asexualki ugaldu eta jatorrizko indibiduoaren kopiak eratzeko. Espezie zelulaniztun askotan, biki edo hirukiak jaio daitezke, klonazio-prozesu natural baten ondorioz.

Organismo bat artifizialki klonatzeko bi modu daude. Bata, enbrioi-zatiketa da, naturalki gertatzen den gertaera bat imitatzen duen teknika. Umeki batetik zelula bat edo gehiago bereizten dira, umeki gehiagori hasiera emateko. Horrela sortzen diren indibiduoak genetikoki guztiz berdinak izango dira.

Besteari transferentzia somatiko nuklear deritzo (ingelesezko SCNT edo somatic cell nuclear transfer). Kasu honetan, genoma diferentziatu bat aktibatu berri den zigoto baten antzera jokatzera bultzatzen da. Teknologia horren bidez sortzen diren indibiduoek beste indibiduo baten DNA nuklear berbera izango dute. Horretarako, emailearen zelula heldu baten nukleoko material genetikoa nukleoa ezabatu zaion obozito batera transferitzen da, transferentzia somatiko nuklear (somatic nuclear transfer) deituriko prozeduraren bidez. Ondoren, zelula-zatiketa bultzatzeko, konposatu kimikoak edo korronte elektrikoa erabiltzen da, emailearen zelula somatikoen konposizio genetiko nuklear bera izango duen umekia sortzeko. Teknika horrekin sortzen diren indibiduoak ez dira guztiz berdinak, obozito enukleatuak zitoplasma eta DNA mitokondriala sortzen dituelako. Klonatutako enbrioia ostalari eme baten umetokira transferitzen da, hor bere garapena jarrai dezan.

Ugaltze-klonazioa

Dolly ardia SCNT bidez zelula heldu baten DNAtik sortu zen lehen animalia izan zen. 1996ko uztailean jaio zen Eskoziako Roslin institutuan, eta 1997ko otsailean eman zen jakitera; hedabideetan eragin nabarmena izan zuen. Biologia modernoaren garapenean egindako lorbide garrantzitsu bat izan zen, ordura arte zelula helduak birprogramatzea ezinezkoa zela uste baitzen. Dollyren sorreran hiru ardik parte hartu zuten: Finn Dorset arrazako ardi batek —DNA genomikoaren emailea. DNA errapeko zelula batetik eskuratu zuten. Dollyk indibiduo horren fenotipoa edo itxura fisikoa zuen— eta Scottish Blackface arrazko bi ardik —oozito enukleatuaren emailea eta ordezko ama—.

SCNT bidezko klonazioak, egun, hainbat arazo dakartza berekin. Teknikaren arrakasta-portzentajea oraindik oso baxua da oro har, % 1 baino baxuagoa kasu gehienetan. Teknika hori aplikatzen zaien zelula gehienak ez dira garatzen, eta, enbrioi bat eratzen dutenen artean, gehienak garapen-fase goiztiarretan hiltzen dira. Jaiotzen diren indibiduo klonatuetan ohikoak dira arazo fisiologikoak eta/edo anatomikoak agertzea.

Klonazioak aplikazio anitz izan ditzake. Nekazaritzan eta abeltzaintzan, nahi diren ezaugarriak dituzten indibiduoak (gaixotasunekiko erresistentzia, ekoizpen altua, kalitate oneko produktuak) aukeratu, eta horien kopiak egiten dira. Klonatutako indibiduoek ugalketarako erabiltzen dira, eta horien ondorengoak izango dira ekoizpenerako erabiliko diren indibiduoak. Klonazio transgeniko delakoan, giza medikuntzarako farmakoak sortzeko asmoarekin eraldatuak izan diren zeluletatik abiatuz, etxe-abereak sortzen dira. Gaixotasun sendaezin batzuen tratamendurako —hemofilia edo fibrosi kistikoa tratatzeko, esaterako—, esnean farmakoak ekoizten dituzten ardiak eta ahuntzak eratu dira. Klonazioa arriskuan dauden edo arraroak diren espezieen kontserbaziorako tresna gisa ere proposatu da, betiere enbrioia garatzeko gertuko espezie bateko eme ostalariak badaude. Momentuz arrakastarik izan ez duten arren, espezie desagertuak berreskuratzeko entseguak ere egiten dira. Azkenik, merkataritza-alderditik hartuta, katuak edo txakurrak eta gisako etxe-abereak klonatzen lan egiten duten enpresak ere badaude.

Klonazio terapeutikoa (biomedikoa) edo zelulen klonazioa

Izaki klonatuak sortzeko erabiltzen den teknika berberaren (transferentzia somatiko nuklearraren) bidez, klonazio-mota honetan umeki klonatu bat eratzen da, emailearen (pazientearen edo gaixoaren) DNAren berdin-berdina duten ama zelula enbrionarioak sortzeko helburuarekin. Klonazio terapeutikoan ez da izaki klonaturik sortuko, umekia blastozisto (enbrioiaren fase goiztiar bat) egoeratik ez delako pasatzen.

Zelula amen berezitasuna da mitosi bidez beren burua berriztatzeko eta espezializatutako zelula-mota anitz (eta, ondorioz, ehun eta organo anitz) bihurtzeko gaitasuna izatea.

Klonazio terapeutikoa

Klonazio terapeutikoaren bidez pertsona gaixo (emailea) batekiko espezifikoak diren zelula amak eratzen dira. Horretarako, emailearen zelula heldu osasuntsu baten DNA ernaldu gabeko eta nukleoa ezabatu zaion obozito batean txertatzen da. Pultsu elektriko edo gai kimikoen bidez, zatiketa bultzatzen da, eta enbrioi bat sortzen da. Enbrioi horri blastozisto-egoera arte zatitzen uzten zaio. Laugarren edo bosgarren egunean, 100 bat zelulako blastozistoko zelula ama pluripotenteak plaka batean ereiten dira, eta prozesuan umekiaren garapena eteten da. Zelula horiek diferentziatu gabeak direnez, potentzialki edozein zelula-mota bihurtzeko gaitasuna dute, eta emailearen DNA genomikoaren berdin-berdina izango dute.

Teorian, klonazio terapeutikoak aplikazio ugari dauzka medikuntzan. Alde batetik, momentuz sendaezinak diren gaixotasun genetiko edo endekapenezko gaixotasunentzako tratamenduak garatzeko balio dezake. Gaixotasun horien artean, besteak beste, alzheimerra, parkinsona, bihotzeko eritasunak, osteoporosia, diabetea, leuzemia eta bizkar-muineko lesioak eta gisako gaixotasun ohiko baina sendaezinak daude. Era berean, zauri larrien ondorioz kaltetutako ehun edo organoak transplantatzeko aukera ematen du, zelula amen bitartez ordezkatzea edo birsortzea posible izango litzatekeelako. Teorikoki, organismoak organoak errefusatzeko aukera gutxi daude, zelula amak transplantea jaso behar duen gaixoaren DNArekin sortzen direlako.

Hala ere, ez da ahaztu behar gaur egun klonazioaren teknikak arrakasta oso baxua duela, gizakien zelula amen lerro bat sortzeko ehunka entsegu direlako beharrezkoak. Hortaz, aplikazio klinikoak ikusi ahal izateko, denbora luzea beharko da. Hori gutxi balitz, eztabaida etikoa sortzen du klonazio-prozesurako beharrezkoak diren kalitate oneko giza obozitoak lortzeak eta zelula amak lortzeko giza enbrioiak suntsitzeak.

Orain arteko ikerketa gehienak blastozistoetatik lortutako zelula ama enbrionarioekin egin diren arren, zelula ama helduak edo somatikoak (ehun helduetatik eratorriak) erabiltzeko aukera ere badago, eta horrek ez du hainbesteko eztabaida sortzen.